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Human (人)TPPA ELISA檢測試劑盒說明原理

發布時間:2018-07-19   點擊次數:1127次

人梅毒(TPPA)試劑盒(ELISA)

使用說明書

 

 

 

 

 

  • 本試劑盒用于體外定性檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中人梅毒(TPPA)。
  • 有效期:6個月
  • 保存條件:2-8℃
  • 本試劑盒僅供科研使用,不得用于臨床診斷

 

 

實驗原理

試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被人梅毒(TPPA)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標本、陰性和陽性對照、HRP標記的檢測抗體,經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人梅毒(TPPA)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),判定陰陽性。

 

樣本處理及要求

1.  血清:將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。
2.  血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。
3.  組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

4.  細胞培養物上清或其它生物標本:請1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

注:標本溶血會影響后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

 

需要而未提供的試劑和器材

  1. 酶標儀(450nm)
  2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
  3. 37℃恒溫箱
  4. 蒸餾水或去離子水

 

試劑盒組成

 

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標板

96孔

48孔

陰性對照

0.3mL

0.3mL

陽性對照

0.3mL

0.3mL

樣本稀釋液

6mL

3mL

檢測抗體-HRP

10mL

5mL

20×洗滌緩沖液

25mL

15mL

按說明書進行稀釋

底物A

6mL

3mL

底物B

6mL

3mL

終止液

6mL

3mL

封板膜

2張

2張

說明書

1份

1份

自封袋

1個

1個

 

注意事項

  1. 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
  2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
  3. 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。
  4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,已經變藍的底物液不能使用。
  5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。
  6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
  7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
  8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
  9. 不能使用過期產品。
  10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應管理好,按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。

 

試劑準備

試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

 

操作步驟

  1.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
  2.   設置陰性對照孔、陽性對照孔和樣本孔,陰性、陽新對照孔各加50μL對照品;
  3.   樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加。
  4.   除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
  5.   棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。
  6.   每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
  7.   每孔加入終止液50μL,15min內,在450nm波長處測定各孔的OD值。

 

實驗結果計算

1. 陰性對照OD值:小于0.2。

2. 陽性對照OD值:大于0.8。

3、陽性判斷(Cut-Off值):陰性對照OD值+0.15,樣本OD值大于閾值,判定為陽性,反之,為陰性。

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